概述（Summary）

产品英文名（Product Name）

TUNEL Apoptosis Detection Kit（Fluorescein-12）

产品中文名

TUNEL 细胞凋亡试剂盒（Fluorescein-12）

产品描述（Description）

细胞凋亡是细胞的一种基本的生物学现象，如核质固缩，线粒体膜电位消失，通透性改变，细胞间连接消失，DNA降解等。细胞在凋亡发生时，会激活一些相关内切酶类，这些酶会切断核小体间的基因组DNA，这种特异且有规律的DNA降解在经DNA电泳检测时，则会呈现180-200bp的DNA梯度条带，而坏死的细胞DNA则呈弥散性条带。TUNEL(rTdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理，即基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上绿色荧光素标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。普健生物生产的TUNEL细胞凋亡试剂盒（Fluorescein-12）是一款灵敏性高，可检测到单细胞水平的凋亡现象，同时可检测到早期凋亡；快速简便，只需将固定好的细胞或组织经染色及洗涤后，即可置于荧光显微镜或者流式细胞仪下进行检测，整个实验操作仅需1-2小时。另外，本试剂盒应用范围广泛，不仅可用于冰冻切片和石蜡切片的凋亡检测，还可用于贴壁或悬浮细胞的凋亡检测。

储存条件（Storage）

储存于-15 ~ -25℃， Fluorescein-12-dUTP Nucleotide Mix避光保存于-20oC。

运输方式（Shipping）

干冰运输。

注意事项（Note）

1.实验需自备阳性对照相关DNase I Buffer及DNase I；用于洗涤细胞的PBS或HBSS；用于封片的抗荧光淬灭封片液； 用于固定的4%多聚甲醛免疫染色固定液及用于通透的含0.1% Triton X-100或终浓度为0.02μg/μl的Proteinase K的免疫染色强力通透液。

2.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法（Standard Operating Procedure）

1.样品预处理

1.1细胞样品

（1）细胞爬片或者涂片经PBS洗涤5分钟后，用PBS配制的4%多聚甲醛室温固定30分钟；

（2）PBS洗涤5分钟；

（3）用含0.2% Triton ® X-100的PBS溶液通透30分钟；

（4）PBS洗涤3次，每次5分钟；

注意：细胞涂片要做好防脱处理。

1.2组织切片

1.2.1石蜡切片

（1）室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中脱蜡10-20分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡10-20分钟。

（2）室温下用梯度乙醇（100%、100%、95%、80%、70%）各浸泡5分钟。

（3）PBS浸泡、洗涤5分钟；

（4）终浓度为0.02μg/μl的Proteinase K溶液通透15-20分钟；

（5）PBS洗涤3次，每次5分钟。

注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

1.2.2冰冻切片

（1）将玻片短暂回温后浸没在用PBS配制的4%多聚甲醛溶液中，室温孵育30分钟。

（2）PBS浸泡、洗涤5分钟；

（3）终浓度为0.02μg/μl的Proteinase K溶液通透15-20分钟；

（4）PBS洗涤3次，每次5分钟。

注意：Proteinase K帮助组织和细胞进行染色剂的通透，孵育时间过长会导致组织或细胞从切片上脱落，过短则造成通透性处理不充分，影响标记效率，为了得到*的结果，可能需要优化通透时间。

2.阳性样本和阴性样本的处理

（1）阳性对照组：加入10 U/ml的DNase I；

（2）阴性对照组：加入等体积1x的DNase I Buffer；

（3）所有分组均加入1x的DNase I Buffer并完全覆盖样本表面，湿盒孵育10min。

（4）去掉多余的液体，并将载玻片用去离子水彻底洗涤3-4次。

3.染色标记

     参考下表配置TUNEL检测液：

注意：TUNEL检测液需现配现用，避免反复冻融。

（1）用去离子水按1:10稀释10x反应平衡液配置为1x反应平衡液。

（2）按照表格比例配置TUNEL检测液，每组切片滴加适量的TUNEL检测液使其完全覆盖（针对涂片、切片或者96孔板，48孔板、24孔板及12孔板，一般50μl TUNEL检测液可足够用于大小约为2.5*2.5cm的样本）;

（3）湿盒避光孵育60分钟;

（4）将切片置于PBS或HBSS溶液中室温浸洗2次，每次5分钟;

（5）吸干切片上多余的水分，避免干片，滴加0.05μg/μl的DAPI溶液，室温湿盒避光孵育10分钟;

（6）将切片置于PBS或HBSS溶液室温浸洗3次，每次5分钟;

（7）用抗荧光猝灭封片剂封片；

4.观察检测

   荧光显微镜下观察，激发波长范围450-500 nm，发射波长范围515-565 nm。

5.流式细胞术检测悬浮细胞

（1）将3-5×10 ⁶个细胞用PBS洗2次，每次4℃，1500rpm，离心10分钟。然后0.5 ml PBS重悬。

（2）固定细胞：加入1 ml用PBS配制的4%多聚甲醛溶液，冰上放置30分钟。

（3）4℃，1500rpm，离心5分钟，去上清并且重悬于1 ml PBS。重复洗一次并用0.5 ml PBS重悬细胞。

（4）通透细胞：细胞可用含0.1% Triton ® X-100的PBS溶液通透，室温放置5分钟，或者用0.1μg/μl的protein k溶液，室温放置5分钟。

（5）1500rpm，离心5分钟，弃上清，细胞重悬于1 ml PBS。

（6）转移细胞至一个新的1.5 ml微量离心管。

（7）1500rpm离心5分钟，去上清并把沉淀重悬在80 μl 1x Equilibration Buffer中。室温孵育30分钟。

（8）细胞在1500rpm离心10分钟，去上清并把沉淀重悬在50 μl rTdT孵育缓冲液中。37℃避光孵育60分钟。

（9）直接加入DAPI染液，使其终浓度为0.05μg/ml，避光室温孵育10分钟。

（10）用流式细胞仪分析细胞。测量495-520nm的Fluorescein-12-dUTP的绿色荧光和364- 454nm的DAPI的蓝色荧光。

注意：DAPI将凋亡和未凋亡的细胞都染成蓝色。只有凋亡的细胞核中有Fluorescein-12-dUTP掺入而产生的绿色荧光。

6常见问题及注意事项

（1） 荧光高背景

?  FITC被非特异性掺入，整个操作过程需保证样品的湿润；

?  高速分裂或增殖的细胞，有时也会出现细胞核DNA断裂；

?  TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的rTdT酶稀释液稀释rTdT酶2-5倍后再操作。稀释后的rTdT酶需当日使用完毕；

?  支原体污染。利用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染；

（2） 荧光信号弱

?  Triton X-100通透或者蛋白酶K作用不充分，可调整通透剂的浓度和孵育时间；

?  荧光淬灭，荧光剂需避光保存和使用；

?  由于凋亡细胞贴壁性减弱，因此在操作过程中应轻柔操作避免细胞丢失；

（3）出现非特异性标记

?  有些细胞和组织里的DNA酶活性比较高，易导致非特异性标记。解决办法是取完细胞或组织后立即对其进行充分固定，阻止酶活；

?  操作过程中可能混入DNA酶的污染。