ReadiPrep 核/细胞质分离试剂盒可逐步分离哺乳动物细胞或组织中的核和细胞质提取物。 分离的蛋白质具有高浓度并保留其生物学活性。 ReadiPrep 核/细胞质分离试剂盒的核和细胞质提取物与许多下游应用兼容，包括酶活性测定和荧光Western印迹等。

样品实验方案

简要概述

1. 用PBS冲洗细胞
2. 加入500 μL细胞质提取缓冲液
3. 离心20秒
4. 收集上清液（细胞质提取物）
5. 将沉淀重新悬浮在150 μL 1X高盐缓冲液中
6. 离心20分钟
7. 收集上清液（核提取物）

溶液配制

工作溶液配制

1.细胞液提取缓冲液（1X）：将100 μL的10X蛋白酶抑制剂（组分C）和1 μL的DTT（组分D）添加到0.9 mL的细胞质提取缓冲液（组分A）中。

2.核提取缓冲液（1X）：将100 μL 10X蛋白酶抑制剂（组分C）和1 μL DTT（组分D）添加到0.9 mL核提取缓冲液（组分B）中。

注意：0.5 mL 1X细胞质提取缓冲液和150 μL 1X核提取缓冲液足以进行1次测定，并根据需要准备新鲜的缓冲液。

实验步骤

1.用冷PBS冲洗细胞1次。 对于悬浮的细胞，请通过离心收集细胞。

2.向细胞中加入500 μL 1X Cytosol提取缓冲液。 对于贴壁细胞，将贴壁细胞刮入1.5 mL离心管中。

3.剧烈涡旋以完全重悬细胞。

4.以16,000 g离心1-2分钟，然后将上清液（细胞质提取物）转移到另一个干净的试管中。 将试管放在冰上以备下游使用或在-80°C下保存。

5.将沉淀重悬于150 μL 1X核提取缓冲液中。

6.剧烈涡旋以完全重悬沉淀。

7.将试管在4°C旋转30分钟。

8.以16,000g离心20分钟，然后将上清液（核提取物）转移到另一个干净的试管中。 将试管放在冰上以备下游使用或在-80°C下保存。

图示

图1.使用ReadiPrep 核/细胞质分离试剂盒（AATBioquest®，Cat＃60000）收集Hela细胞的核和细胞质提取物。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（AATBioquest®，Cat＃11100）对蛋白质进行定量。 A.在有或没有HDAC抑制剂曲古抑菌素A的情况下孵育8ug核或细胞质提取物，并通过Amplite 荧光HDAC活性测定试剂盒（AATBioquest®，Cat#13601）测量HDAC活性。 B.使用40ug总蛋白的核或细胞质提取物。 2 ug / ml兔抗HDAC1抗体用于探测硝酸纤维素膜过夜。 使用了10 ug / ml的iFluor 647山羊抗兔IgG（H + L）（AATBioquest®，Cat#16809）。 该检测通过UVP多光谱成像系统（Biolite）可视化。 M：标记，Nu：核提取物，细胞：细胞质提取物。

图2.使用ReadiPrep Nucleus / Cytosol分离试剂盒收集了Jurkat细胞的核和细胞质提取物。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（AATBioquest®，Cat＃11100）对蛋白质进行定量。 在有或没有HDAC抑制剂Trichostain A的情况下孵育8 μg核或细胞质提取物，并通过Amplite 荧光HDAC活性测定试剂盒（AATBioquest®，Cat#13601）测量HDAC活性。

图3.使用ReadiPrep Nucleus / Cytosol Fractionation Kit收集了Hela细胞的核和细胞质提取物。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（AATBioquest®，Cat＃11100）对蛋白质进行定量。 在有或没有HDAC抑制剂Trichostain A的情况下孵育8 μg核或细胞质提取物，并通过Amplite 荧光HDAC活性测定试剂盒（AATBioquest®，Cat#13601）测量HDAC活性。

参考文献

Studied by Rapid Fractionation of Barley (Hordeum vulgare) Protoplasts
Authors: Gardestrom, P.; Wigge, B., Influence of Photorespiration on ATP/ADP Ratios in the Chloroplasts, Mitochondria, and Cytosol
Journal: Plant Physiol (1988): 69-76

and mitochondria
Authors: Lilley, R. M.; Stitt, M.; Mader, G.; Heldt, H. W., Rapid fractionation of wheat leaf protoplasts using membrane filtration : the determination of metabolite levels in the chloroplasts, cytosol
Journal: Plant Physiol (1982): 965-70