胆碱及其代谢产物在细胞膜的结构完整性和信号传导以及胆碱能神经传递（乙酰胆碱合成）中起着重要作用。它是通过其代谢产物三甲基甘氨酸参与S-腺苷甲硫氨酸合成途径而获得甲基的主要来源。胆碱缺乏症可能导致肝脏疾病，动脉粥样硬化以及可能的神经系统疾病。尽管胆碱在中枢神经系统中作为乙酰胆碱和膜磷脂酰胆碱的前体具有重要作用，但胆碱在精神疾病中的作用尚未得到研究。该Amplite 胆碱定量试剂盒提供了最灵敏的胆碱定量方法之一。该试剂盒使用Amplite Red量化胆碱的浓度，这与胆碱氧化酶介导的酶偶联反应中过氧化氢的产生有关。胆碱的量与在酶偶联反应循环中形成的过氧化氢的浓度成比例。在存在过氧化物酶的情况下，Amplite Red的荧光强度与过氧化氢的形成成比例，该过氧化氢转化为胆碱的浓度。该测定可以容易地用荧光酶标仪读取，或者也可以使用光吸收酶标仪在?570 nm处读取测定值。

样品实验方案

简要概述

1. 准备并添加胆碱标准品和/或测试样品（50 μL）
2. 准备并添加胆碱测定工作溶液（50 μL）
3. 在室温下孵育15-60分钟
4. 检测Ex / Em = 540/590nm时的荧光强度

溶液配制

储备溶液配制

1. Amplite Red储备液（250X）：将40 μL DMSO（组分E）添加到Amplite Red底物（组分A）的小瓶中，应立即使用储备溶液。应将所有剩余的溶液等分，并在-20^oC重新冷冻。注意1：避免重复冻融循环。注意2：在存在硫醇（例如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇）的情况下，Amplite Red底物不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应不高于10 μM。Amplite Red底物在高pH（> 8.5）下也不稳定。因此，反应应在pH 7-8下进行。建议使用提供的测定缓冲液（pH 7.4）。

2.胆碱标准储备液（50 mM）：将400 μL ddH₂O加入胆碱标准液（组分C）的小瓶中，并充分混合。注意：未使用的胆碱储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在-20^oC下储存。

标准溶液配制

将20 μL胆碱标准储备液（50mM）加到980 μL分析缓冲液（组分D）中，生成1000 μM标准溶液。注意：  稀释的胆碱标准溶液不稳定，应在4小时内使用。将30 μL的1000 μM标准溶液加到970 μL的测定缓冲液（组分D）中以生成30 μM胆碱标准溶液，然后进行1：3系列稀释，以得到10、3、1、0.3、0.1、0.03和0 μM胆碱标准。

工作溶液配制

胆碱测定工作溶液：
将5 mL测定缓冲液（组分D）添加到胆碱探针瓶（组分B）中，并充分混合。在胆碱探针中加入20 μL Amplite Red 储备溶液（250X）。

实验步骤

表1.黑色96孔板中胆碱标准品和测试样品的布局。CS =胆碱标准（CS1-CS7）；BL =空白对照；TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

胆碱测定：

1.如表1和表2所述，将胆碱标准品和含胆碱的测试样品添加到黑色96孔板中。

2.在胆碱标准液，空白对照和测试样品的每个孔中加入50 μL胆碱测定工作溶液（表2），使总胆碱测定体积为100 μL /孔。 注意：对于384孔板，将25 μL样品和25 μL测定反应混合物加到每个孔中。

3.避光保存，室温下孵育反应15至60分钟。

4.使用荧光酶标仪在Ex / Em = 530-570 nm / 590-600 nm（最佳Ex / Em = 540/590 nm）处检测荧光强度。

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