适用仪器

样品实验方案

简要概述

1. 在生长培养基中准备细胞
2. 用测试化合物处理细胞以诱导超氧化物
3. 添加MitoROS 580工作溶液
4. 在37°C下将细胞染色30-60分钟
5. 检测Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）处的荧光增加（底部读取模式）或使用配备TRITC滤光片的荧光显微镜

溶液配制

储备溶液配制

1. MitoROS 580储备溶液（500X）：将50 μL DMSO（组分C）添加到MitoROS 580（组分A）的小瓶中，并充分混合以制成500X MitoROS 580储备液，避光。 注意：25 μL 500X MitoROS 580储备溶液足以用于1个板。 为了存放，请将管子紧紧密封。

工作溶液配制

将25μL的500X MitoROS 580储备溶液添加到10 mL的测定缓冲液（组分B）中，并充分混合以制成MitoROS 580工作溶液。 注意：此MitoROS 580工作溶液在室温下至少可稳定2小时。

实验步骤

1. 在所需的缓冲液（例如PBS或HHBS）中，用10 μL 10X测试化合物（96孔板）或5 μL 5X测试化合物（384孔板）处理细胞。 对于对照孔（未处理的细胞），添加相应量的化合物缓冲液。

2. 为了诱导超氧化物，将细胞板在37°C下孵育所需的时间，避光。 注意：我们在37°C下用50 μM抗霉素A（AMA）处理HeLa细胞30分钟，以诱导超氧化物。 有关详细信息，请参见图1。

3. 将100 μL /孔（96孔板）或25 μL /孔（384孔板）的MitoROS 580工作溶液添加到细胞板中。

4. 将细胞在37°C下孵育30至60分钟。

5. 使用荧光酶标仪（Ext / Em = 540/590 nm（Cutoff = 570 m））检测荧光强度，或者使用带有TRITC滤光片的荧光显微镜观察细胞。

图示

图1.使用Cell Meter 荧光细胞内超氧化物检测试剂盒（Cat＃22971）在HeLa细胞中测量超氧化物的荧光图像。 将100,000个细胞/孔/ 100 μL的HeLa细胞在96孔黑色板中接种过夜。 AMA处理：将细胞在37°C下用50 μM抗霉素A（AMA）处理30分钟，然后与MitoROS 580孵育1小时。 未经处理的对照：HeLa细胞与MitoROS 580在37°C下孵育1小时，未经AMA处理。 使用带有TRITC滤光片的荧光显微镜检测荧光信号。

图2.使用Cell Meter 荧光细胞内超氧化物检测试剂盒（Cat＃22971）检测HeLa细胞中的细胞内超氧化物。 将100,000个细胞/孔/ 100 μL的HeLa细胞在96孔黑色板中接种过夜。 将细胞与50 μM绿脓素（Pyo）孵育； 50 μM抗霉素A（AMA）或未经处理（对照）在37oC下放置30分钟。 然后将细胞与MitoROS 580在37℃孵育1小时。 使用CLARIOstar酶标仪（BMG Labtech）以底部读取模式在Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）下检测荧光信号。

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