DiA是一种亲脂性荧光染色剂，用于标记膜和其他疏水结构。它具有环境敏感的荧光，尽管在水中呈弱荧光，但与膜或亲油生物分子（如蛋白质）结合时，荧光会大大增强。一旦应用于细胞，这种染料在细胞质膜内横向扩散，从而在最佳浓度下对整个细胞进行均匀染色。

样品分析方案

概述

用测试化合物（200μL/样品）制备细胞

添加膜联蛋白V缀合物测定溶液

室温孵育30-60分钟

用流式细胞仪或荧光显微镜分析

操作步骤

1.用膜联蛋白V缀合物制备和孵育细胞：

1.1制备膜联蛋白V结合测定缓冲液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl 2，pH 7.4。

1.2用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。

1.3离心细胞，得到1-5×105个细胞/管。

1.4将细胞重悬于200μL膜联蛋白V结合测定缓冲液中（来自步骤1.1）。

1.5在细胞中加入2μL膜联蛋白V结合物。

可选：在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭，用于坏死细胞。

1.6在室温下孵育30至60分钟，避光。

1.7在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μL膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）以增加体积（参见下面的步骤1.8）。

1.8使用流式细胞仪或荧光显微镜监测荧光强度（参见下面的步骤2或3）。

2.使用流式细胞仪分析：

通过使用具有适当过滤器的流式细胞仪来量化膜联蛋白V缀合物。

注意：粘附细胞上的膜联蛋白V结合流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。 然而，Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。 和van Engelend等人（见参考文献1和2）。

3.使用荧光显微镜分析：

3.1移取步骤1.6的细胞悬液，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，然后用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）重悬细胞。 将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。

注意：对于粘附细胞，建议直接在盖玻片上生长细胞。 与膜联蛋白V缀合物孵育（步骤1.6）后，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，并将膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。 在与膜联蛋白V缀合物孵育后，细胞也可以在2％甲醛中固定，并在显微镜下观察。

3.2在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白V缀合物的凋亡细胞。

参考文献

Cyclic RGD peptide-modified liposomal drug delivery system for targeted oral apatinib administration: enhanced cellular uptake and improved therapeutic effects
Authors: Zhiwang Song, Yun Lin, Chan Feng Xia Zhang, Yonglin Lu, Yong Gao, Chunyan Dong
Journal: International Journal of Nanomedicine (2017): 1941

In vivo imaging system for explants analysis—A new approach for assessment of cell transplantation effects in large animal models
Authors: Weronika Zarychta-Wisniewska, Anna Burdzinska, Radoslaw Zagozdzon, Bartosz Dybowski, Marta Butrym, Zdzislaw Gajewski, Leszek Paczek
Journal: PloS one (2017): e0184588

Influence of Particle Geometry on Gastrointestinal Transit and Absorption following Oral Administration
Authors: Dong Li, Jie Zhuang, Haisheng He, Sifan Jiang, Amrita Banerjee, Yi Lu, Wei Wu, Samir Mitragotri, Li Gan, Jianping Qi
Journal: ACS Applied Materials & Interfaces (2017)

Mesenchymal stem cells increase skin graft survival time and up-regulate PD-L1 expression in splenocytes of mice
Authors: Ali Moravej, Bita Geramizadeh, Negar Azarpira, Amir-Hasan Zarnani, Ramin Yaghobi, Mehdi Kalani, Maryam Khosravi, Amin Kouhpayeh, Mohammad-Hossein Karimi
Journal: Immunology Letters (2017)

Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model
Authors: Ayesha B Alvero, Dongin Kim, Eydis Lima, Natalia J Sumi, Jung Seok Lee, Carlos Cardenas, Mary Pitruzzello, Dan-Arin Silasi, Natalia Buza, Tarek Fahmy
Journal: Scientific Reports (2017)

On-Demand Drug Releasing from Dual Targeting Small Nanoparticles Triggered by High Intensity Focused Ultrasound Enhanced Glioblastoma Targeting Therapy
Authors: Zimiao Luo, Kai Jin, Qiang Pang, shun shen, Zhiqiang Yan, Ting Jiang, Xiaoyan Zhu, Lei Yu, Zhiqing Pang, Xinguo Jiang
Journal: ACS Applied Materials & Interfaces (2017)

Overexpression of c-Met in bone marrow mesenchymal stem cells improves their effectiveness in homing and repair of acute liver failure
Authors: Kun Wang, Yuwen Li, Tiantian Zhu, Yongting Zhang, Wenting Li, Wenyu Lin, Jun Li, Chuanlong Zhu
Journal: Stem Cell Research & Therapy (2017): 162

The accelerated blood clearance phenomenon of PEGylated nanoemulsion upon cross administration with nanoemulsions modified with polyglycerin
Authors: Yuqing Su, Lirong Wang, Kaifan Liang, Mengyang Liu, Xinrong Liu, Yanzhi Song, Yihui Deng
Journal: Asian Journal of Pharmaceutical Sciences (2017)

A dual brain-targeting curcumin-loaded polymersomes ameliorated cognitive dysfunction in intrahippocampal amyloid-β1--42-injected mice
Authors: Tingting Jia, Zhiguo Sun, Ying Lu, Jie Gao, Hao Zou, Fangyuan Xie, Guoqing Zhang, Hao Xu, Duxin Sun, Yuan Yu
Journal: International Journal of Nanomedicine (2016): 3765

Annonaceous acetogenins nanosuspensions stabilized by PCL-PEG block polymer: significantly improved antitumor efficacy
Authors: Jingyi Hong, Yanhong Li, Yijing Li, Yao Xiao, Haixue Kuang, Xiangtao Wang
Journal: International Journal of Nanomedicine (2016): 3239