PhosphoWorks 荧光法磷酸盐检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测磷酸盐的试剂盒 ，细胞使用多种不同的磷酸盐（Pi）和多聚磷酸酯作为酶的底物、第二信使、膜结构复合物和重要的能力存储器。在许多生物学过程中都含有磷酸盐。例如：磷酸酶、ATP酶和其它几种酶催化的生化反应中，催化磷酸酯底物释放无机磷酸盐。多种磷酸酯酶催化难以检测，因为没有找到合适的底物。使用传统的比色检测法或者放射性同位素检测法检测无机磷酸盐的释放通常是必需的。PhosphoWorks 荧光法磷酸盐检测试剂盒使用我们的红色荧光磷酸盐检测器，已成功检测任何催化产生Pi的酶的活性。本试剂盒提供灵敏的磷酸盐检测法，替代有危险性的放射性检测法和低灵敏度的比色分析法。本检测法对磷酸盐的测定是基于：光吸收的改变和我们的新的磷酸盐荧光检测器。本试剂盒提供所有必需试剂，包括磷酸盐检测器、磷酸盐标准品和检测缓冲液。试剂盒可以对溶液中浓度低至0·1 礛的磷酸盐进行定量。它可以用来测定磷酸酶(例如 GTPases 和 ATPases)释放磷酸盐的动力学，通过偶联的两种酶促反应。本检测法可以用于96或384微孔板分析，并且无需任何分步操作就可以轻易地实现自动化检测。

操作步骤

简要概述

准备测试样品或磷酸盐标准品（40μL）
加入等体积的分析缓冲液（40μL）
添加磷酸盐工作溶液（20μL）
在室温下孵育15至60分钟
监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度（截止= 570 nm）

溶液制备

1.制备储备溶液

        除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1磷酸盐储备液（125X）：
在磷酸盐（组分B）中加入20μLDMSO，制成125X磷酸盐原液。

2.制备标准溶液

磷酸盐标准溶液
将50μL的1mM KH 2 PO 4（组分C）加入950μL去离子水或酶反应缓冲液中，得到50μM磷酸盐标准溶液（PS7）。 取50μM磷酸盐标准溶液（PS7）并进行1：2连续稀释，用去离子水或酶反应缓冲液得到连续稀释的磷酸盐标准品（PS6-PS1）。

3.制备工作溶液

将20μL125X磷酸盐储备溶液加入2.5 mL无菌H₂O中，充分混合，制成磷酸盐工作溶液。 避免潜在的Pi污染。 注意：避免磷酸盐（组分B）直接暴露在光线下。 由于该测定法对Pi的高灵敏度，使用无Pi实验室器皿和试剂极为重要。

样品实验方案

在pH 6.5至7.4下进行磷酸盐测定

表1.实心黑色96孔微孔板中磷酸盐标准品和测试样品的布局。

PS =磷酸盐标准品（PS1-PS7,0.78至50μM），BL =空白对照，TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成。

1.根据表1和2中提供的布局制备磷酸盐标准品（PS），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用20μL试剂代替40μL。

2.向磷酸盐标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入40μL测定缓冲液（组分A）和20μL磷酸盐工作溶液，使总磷酸盐测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入20μL测定缓冲液（组分A）和10μL磷酸盐工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.将反应混合物在室温下孵育15至60分钟。

4.用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的荧光板读数器监测荧光增加。

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算Pi样本。 我们建议使用在线线性回归计算器，该计算器可在以下位置找到：

图1.使用Novostar酶标仪（BMG Labtech），在实心黑色96孔板上用PhosphoWorks 荧光磷酸盐测定试剂盒测量磷酸盐剂量响应。

参考文献

Sacrificial crystal templating of hyaluronic acid-based hydrogels
Authors: Richelle C Thomas, Paul E Chung, Shan P Modi, John G Hardy, Christine E Schmidt
Journal: European Polymer Journal (2016)

Osteogenic cell cultures cannot utilize exogenous sources of synthetic polyphosphate for mineralization
Authors: Marianne B Ariganello, Sidney Omelon, Fabio Variola, Rima M Wazen, Pierre Moffatt, Antonio Nanci
Journal: Journal of cellular biochemistry (2014): 2089--2102