Cell Meter 荧光法细胞内pH检测试剂盒  是美国AAT Bioquest生产的胞内pH检测试剂盒 ，细胞内pH变化涉及多种生理和病理过程，包括细胞增殖，细胞凋亡，受精，恶性肿瘤，多药耐药性，离子转运，溶酶体贮积症和阿尔茨海默病。 Cell Meter 荧光细胞内pH测定试剂盒利用AAT Bioquest专有的荧光指示剂测量相对细胞内pH变化。它是一种均相的，动力学的活细胞荧光测定法，它使用标准程序或酸负荷程序。设计标准方案用于治疗靶标，同时治疗时细胞内pH降低。 “酸负荷”程序旨在测量与GPCR活化或生长因子活性引起的细胞代谢变化相关的细胞内pH的增加。在“酸负荷”程序中，在将荧光pH染料以最小体积加载到细胞中之后加入氯化铵溶液。该“酸加载”步骤之后是在相对大体积（~4X）的缓冲液中加入激动剂。突然的体积变化引发来自细胞的氨（NH 3）流出，导致细胞内pH的快速降低，并因此导致荧光信号的降低。通过相对荧光信号增加测量激动剂对随后的细胞内pH恢复的影响。

操作步骤

运行pH测定以获得标准细胞

1.将100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）RatioWorks TM BCFL，AM染料加工溶液加入到细胞板中。注意：如果化合物干扰血清，重要的是用HHBS缓冲液替换生长培养基（96孔板100μL/孔或染料加载前384孔板25μL/孔）。

2.将染料加载板在细胞培养箱中孵育30分钟，然后在室温下将板孵育另外30分钟。注意：如果测定需要37°C，立即进行实验，无需进一步室温孵育。

3.使用HHBS或所需的缓冲液制备复合板。

4.通过监测Ex / Em = 490 / 535nm（截止= 515nm）或505 / 535nm和430 / 535nm（截止= 515nm）处的荧光进行pH测定以进行比率测量。添加化合物为50μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）。注意：化合物应在化合物添加后3至5分钟内完成，但在测定开发过程中建议至少8分钟的数据收集。

运行pH测定酸

1.从细胞板上除去生长培养基。

2.将50μL/孔/ 96孔板RatioWorks™BCFL，AM染料加工溶液添加到细胞板中。

3.将染料加载板在细胞培养箱中孵育30分钟，然后在室温下将板孵育另外30分钟。注意：如果测定需要37°C，立即进行实验，无需进一步室温孵育。

4.加入5μL的220mM NH 4 Cl并将板离心5秒。在室温下孵育15分钟。注意：NH4Cl溶液应在HHBS（组分C）中新鲜制备。

5.使用HHBS或所需的缓冲液制备复合板。

6.通过监测Ex / Em = 490 / 535nm（截止= 515nm）或505 / 535nm和430 / 535nm（截止= 515nm）处的荧光进行pH测定以进行比率测量。添加的化合物为200μL/孔/ 96孔板。注意：化合物应在化合物添加后3至5分钟内完成，但在测定开发过程中建议至少8分钟的数据收集。

示例数据分析和数据

        从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算Carbachol样品。 

图1. CHO-M1细胞中的卡巴胆碱剂量反应。 在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-M1细胞以每100μL/孔60,000个细胞接种过夜。 将生长培养基用50μL/孔的RatioWorks BCFL，AM染料加载溶液替换37℃1小时，然后用5μL/孔的220mM NH 4 Cl孵育15分钟。 通过FlexStation（Molecular Devices）添加Carbachol（200μL/孔）以达到最终指示的浓度。 使用Ex / Em = 490 / 535nm（截止= 515nm）产生荧光信号。

参考文献

The Redox Status of Cancer Cells Supports Mechanisms behind the Warburg Effect
Authors: Jorgelindo Da Veiga Moreira, Minoo Hamraz, Mohammad Abolhassani, Erwan Bigan, Sabine Pérès, Loic Paulevé, Marcel Levy Nogueira, Jean-Marc Steyaert, Laurent Schwartz
Journal: Metabolites (2016): 33