Cell Meter TUNEL细胞凋亡测定试剂盒是一个强大的工具，可方便地检测由DNA的片段化引起的细胞凋亡。该测定是非放射性且快速的。TUNEL测定法使用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）催化TMR-dUTP在片段DNA的游离3'-羟基末端的掺入。通过荧光显微镜（Cy3或TRITC滤光片组）分析所得的TMR标记的DNA。它的红色发射可以方便地与GFP标记的靶标多路复用。荧光TMR标记的核苷酸的直接掺入可显着减少测试步骤。该试剂盒经过优化，可检测固定细胞和福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片中的凋亡。

样品分析方案

概述

根据需要处理样品

在冰上用4％甲醛溶液固定细胞30分钟

在冰上用70％冰冷的乙醇透化细胞60分钟

将TdT染色溶液添加到样品中并在37°C下孵育60分钟

使用带有Cy3滤光片组的荧光显微镜检测荧光强度

工作溶液配制方案

对于1test，混合以下试剂以使总体积为51 μL；
45 μL TdT反应缓冲液（组分D）
5 μL CoCl ₂ （组分C）
0.5 μL TF5-dUTP（组分B）
0.5 μL TdT酶（组分A）。
注意：TdT染色溶液应立即使用。

操作步骤

1. 根据需要处理样品。
2. 用您选择的缓冲液（例如含Ca ⁺²和Mg ^+2的 PBS）洗涤细胞。
3. 通过在PBS中加入100 μL 4％多聚甲醛固定细胞，并在冰上孵育30分钟。
4. 除去固定液并用PBS洗涤细胞。
5. 向细胞中加入100 μL 70％的冰冷乙醇，并在冰上孵育60分钟。
   注意：在使用前，可将细胞在此步骤中于-20°C存放几天。
6. 除去酒精并用PBS洗涤细胞。
   注意：对于阳性对照，将固定细胞与2-5 μg / mL的DNAse在含有Ca ⁺²和Mg ⁺²的PBS中于37°C 孵育60分钟。除去DNAse并彻底清洗细胞，然后继续执行其余的操作步骤。
7. 向细胞中加入50 μL TdT染色溶液，并在37°C下孵育60至120分钟。
8. 除去TdT工作溶液，并用PBS洗涤细胞。
9. 将细胞重悬于PBS中，并使用575/26 nm滤光片（PE通道）通过流式细胞仪或带有Cy3滤光片组的荧光显微镜检测荧光强度。

组织染色方案

去石蜡和水化方案

1. 通过将载玻片在Coplin广口瓶中在室温下浸入新鲜的二甲苯中5分钟，从而对组织切片（附着在载玻片上）进行脱蜡。再重复一次。（共2次洗涤）
2. 将载玻片在室温下在Coplin广口瓶中浸入100％乙醇中5分钟，以洗涤样品。
3. 通过在室温下将载玻片浸入各种浓度的酒精（100％，95％，85％，70％，50％）中，然后分别在室温下浸没5分钟，使样品重新水化。
4. 在室温下将载玻片浸入0.85％NaCl中5分钟，以洗涤样品。
5. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。重复一遍。（共2次洗涤）

固定方案

1. 通过在室温下将载玻片浸入PBS中的4％多聚甲醛溶液中15-20分钟来固定组织切片。
2. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。重复一遍。（共2次洗涤）
3. 除去液体，然后将载玻片放在平坦的表面上。用100 μL 20 μg / mL蛋白酶K溶液处理组织切片。添加足够覆盖整个组织表面。在室温下孵育载玻片10分钟。
4. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。
5. 通过在室温下将载玻片浸入PBS中的4％多聚甲醛溶液中15-20分钟来固定组织切片。
6. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。重复一遍。（共2次洗涤）

染色方案

1. 可选：对于阳性对照，将固定的样品与2-5 μg / mL的DNAse在含有Ca ⁺² 和Mg ⁺²的PBS中于37°C 孵育60分钟。除去DNAse，并用PBS彻底清洗细胞，并继续进行其余操作。
2. 向样品中加入50 μL TdT染色溶液，并在37°C下孵育60至120分钟。
3. 除去TdT工作溶液，并用PBS洗涤样品。
4. 加入含DAPI的封固剂（AAT Bioquest Cat＃20005），并用Cy3滤光片组检测荧光强度荧光显微镜。

图示

图1. 用 HeLa细胞进行TUNEL分析的荧光图像。固定HeLa细胞，并在37°C下分别使用及不使用DNAse处理60分钟。然后将细胞用Cell Meter™固定细胞和组织TUNEL细胞凋亡检测试剂盒染色。DNA链断裂在DNAse处理的细胞中表现出强烈的荧光染色。使用Cy3滤光片组在荧光显微镜下采集信号。

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