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ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物
物品单位 价格 品牌
2472 AAT Bioquest
  • 产地:American
  • 型号:100 Tests
  • 货号:CS13290
  • 发布日期: 2022-03-01
  • 更新日期: 2022-03-24
产品详细说明
产地 American
品牌 AAT Bioquest
货号 CS13290
用途范围 Research Grade
纯度 98%%
CAS编号
规格 100 Tests
是否进口
简要概述

ApoSight 绿色半胱天冬酶3/7底物是第一个直接检测活细胞中半胱天冬酶活性的荧光探针。它由三个部分组成,包括a)荧光团,b)半胱天冬酶选择性肽片段(DEVD),以及c)细胞穿透部分。细胞穿透部分将探针带入活细胞。进入活细胞后,半胱天冬酶选择性肽片段被半胱天冬酶裂解以释放荧光团。恢复的荧光强度直接与要检测的胱天蛋白酶3/7的活性有关。与活细胞中现有的半胱天冬酶测定相比,ApoSight Green Caspase 3/7底物更加稳定,方便和准确。 ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物释放出Ex / Em?490/520 nm的荧光团。如NucView试剂所报道的,它不需要DNA相互作用就能发荧光。如FMK肽探针所报道的,它不抑制胱天蛋白酶活性。尽管胱天蛋白酶的荧光FMK肽抑制剂被广泛用于检测活细胞中的胱天蛋白酶活性,但该技术有一些严重的局限性:a)FMK半胱天冬酶抑制剂具有很高的细胞毒性,因为FMK肽与活性胱天蛋白酶共价结合。 b)FMK肽与caspase的不可逆共价结合会抑制caspase活性,导致假阳性凋亡。 C) FMK分析具有极高的背景,并且需要大量洗涤,从而导致极低的通量。 d)FMK肽在水溶液中不稳定,必须立即使用。 ApoSight Green Caspase 3/7底物可以用96孔或384孔板进行实验,并易于适应自动化。

 

适用仪器


流式细胞仪  
激发: 488nm激光
发射: 530/30nm滤波片
通道: FITC通道
荧光显微镜  
激发: FITC滤波片组
发射: FITC滤波片组
推荐孔板: 黑色透明


产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.使用96孔板的密度为5×104至2×105细胞/ 100 μL /孔的待测化合物制备细胞
2.加入等体积的ApoSight Caspase 3/7底物工作溶液
3.在5%CO2培养箱中于37°C孵育60分钟
4.用HHBS洗涤细胞1-2次
5.使用带有530/30 nm滤波片(FITC通道)的流式细胞仪或带有FITC滤波片组的荧光显微镜分析细胞

 

溶液配制

1.储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样,并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。

ApoSight Green Caspase 3/7底物储备液(200X)
在ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 μL DMSO,制成200X ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意,一次性使用等分试样,以避免重复的冻融循环。
 
2.工作溶液配置
ApoSight Green Caspase 3/7底物工作溶液
在ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 μL DMSO,制成200X ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意,一次性使用等分试样,以避免重复的冻融循环。

点击查看细胞制备方案

 

样品示例及操作

悬浮培养中诱导细胞凋亡的实例

1.用2μg/ mL喜树碱处理Jurkat细胞3小时
2.用1μM星形孢菌素处理Jurkat细胞3-4小时
3.用4μg/ mL喜树碱处理HL-60细胞4小时
4.用1μM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。
注意,应对每个细胞系进行单独评估,以确定诱导凋亡的最佳细胞密度。

 

荧光显微镜的样品方案

1.用5×104至2×105个细胞/ 100 μL /孔/ 96孔板的密度制备含待测化合物的细胞。
2.向细胞中加入等体积的Caspase 3/7底物工作溶液(100 μL /孔/ 96孔板)。
3.在5%CO2培养箱中于37°C孵育60分钟。
4.用HHBS或您选择的缓冲液洗涤细胞1-2次。
5.使用FITC滤波片组的荧光显微镜成像。

 

流式细胞术的样品方案

1.以1:200的比例将200 X ApoSight Green Caspase 3/7底物原液添加到细胞溶液中,并在5%CO2培养箱中于37°C孵育细胞60分钟。
注意,用于ApoSight Green Caspase 3/7底物标记的细胞可浓缩至约5 X 106细胞/ mL。适当的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。
2.使用530/30 nm滤波片(FITC通道),通过流式细胞仪检测荧光强度。
注意,要增加信号/背景比,请以约200 g的速度旋转细胞5分钟,用1 mL洗涤缓冲液(例如HHBS或所选缓冲液)洗涤细胞,然后将细胞重悬至所需的洗涤量。

 

图示

图1.使用ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物检测Jurkat细胞中胱天蛋白酶3/7活性。将Jurkat细胞(200,000个细胞/孔/ 96孔板)用1μM星形孢菌素或DMSO处理4小时。将细胞与Caspase 3/7底物工作溶液在37°C下孵育1小时。使用FITC滤波片组,用荧光显微镜拍摄图像。

 

参考文献

Cell culture conditions affect the ability of high content imaging assay to detect drug-induced changes in cellular parameters in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).
Authors: Balasubramanian, Bharathi and Belak, Vaclav and Verma, Isha and Prysiazhniuk, Yeva and Sannajust, Frederick and Trepakova, Elena S
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Authors: Guisier, Florian and Bohn, Pierre and Patout, Maxime and Piton, Nicolas and Farah, Insaf and Vera, Pierre and Thiberville, Luc and Salaün, Mathieu
Journal: PloS one (2017): e0180576

Polyphenols act synergistically with doxorubicin and etoposide in leukaemia cell lines.
Authors: Mahbub, A A and Le Maitre, C L and Haywood-Small, S L and Cross, N A and Jordan-Mahy, N
Journal: Cell death discovery (2015): 15043

Monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization.
Authors: Smith, Graham S T and Voyer-Grant, Janine A M and Harauz, George
Journal: Journal of visualized experiments : JoVE (2012)


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