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Amplite 荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒 绿色荧光
物品单位 价格 品牌
3924 AAT Bioquest
  • 产地:American
  • 型号:1 kit
  • 货号:CS12601
  • 发布日期: 2022-03-01
  • 更新日期: 2022-03-24
产品详细说明
产地 American
品牌 AAT Bioquest
货号 CS12601
用途范围 Research Grade
纯度 98%%
CAS编号
规格 1 kit
是否进口
简要概述

Amplite 荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于β-半乳糖苷酶 的试剂盒,大肠杆菌β-半乳糖苷酶是一个四聚体。β-半乳糖苷酶的每个单元包含五个区域,其中第三个是激活位点。它是细胞中一种必需酶。缺乏这种酶会导致半乳糖唾液沉积症和Morquio B综合症。在大肠杆菌中,β-半乳糖苷酶通过LacZ操作子激活。LacZ表达的检测已经成为已经成为惯例,已经能够在每个细胞中检出少至5个复制的β-半乳糖苷酶。Amplite 荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒 *绿色荧光* 使用一种荧光性半乳糖苷酶底物,它可以很敏感地的辨别LacZ+细胞和LacZ-细胞。它可以用于ELISA检测系统中,β-半乳糖苷酶的检测;也可以用于细胞表达LacZ基因的检测。这种半乳糖苷酶-断裂产物的Ex/Em = 490/520。nm,可以通过带有FITC滤光器的荧光设备检测。

 

适用仪器


荧光酶标仪  
激发: 490nm
发射: 525nm
cutoff: 515nm
推荐孔板: 黑色孔板


产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.用LacZ基因制备稳定或瞬时转染的细胞
2.用测试化合物孵育细胞(样品)
3.裂解细胞
4.将裂解液转移至微量滴定板
5.添加FDG工作解决方案
6.根据细胞类型,在室温或37°C孵育至少5分钟
7.添加停止解决方案
8.监测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样,并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 FDG储备溶液(1倍):
将125 μL DMSO(组分E)加入FDG(组分A)小瓶中,制成1X FDG储备液。 注意:25 μL FDG足以装满1个板,避光。

 

2.标准溶液

β-半乳糖苷酶标准品
可选(如果需要标准曲线):用0.3%β-巯基乙醇测定缓冲液制备一系列β-半乳糖苷酶(大肠杆菌)标准品的稀释液。 将标准曲线上每个点的等分试样50 μL转移至平板的对照孔中。 β-半乳糖苷酶的最高推荐量为200 mU / mL(200-400 ng)。 建议对标准曲线进行2倍系列稀释,包括8个点。 注意:调整标准曲线以适合特定的实验条件,例如细胞类型,数量,转染效率和培养板的大小。 每次进行测定时,必须新鲜制备标准曲线的稀释液。

 

3.工作溶液

3.1 0.3%β-巯基乙醇测定缓冲液:
将30 μLβ-巯基乙醇(组分F)添加到10 mL反应缓冲液(组分B)中,并充分混合。
注意:制备酶稀释缓冲液需要额外的缓冲液,用于生成标准曲线。

3.2 FDG工作方案:
将25 μL 1X FDG储备溶液加到5 mL的0.3%β-巯基乙醇测定缓冲液中。 注意:请勿将FDG溶液在室温下长时间放置,否则会发生自发水解。

3.3 裂解缓冲液工作液:
使用前,将5 μLβ-巯基乙醇(组分F)加入5 mL裂解缓冲液(组分D)中。 注意:在裂解细胞之前,始终将0.1%β-巯基乙醇添加到裂解缓冲液中

 

样品操作及分析

表1.细胞培养板推荐的Lysis Buffer工作溶液体积

培养板类型 裂解缓冲液工作溶液(μL /孔)
96孔板 50
24孔板 250
12孔板 500
6孔板 1000
60毫米板 2000
100毫米板 4000

1.从哺乳动物细胞制备细胞提取物

1.1用测试化合物处理含有LacZ基因的细胞所需的时间。

1.2用1X PBS洗涤细胞两次。不要移动细胞。

1.3用Lysis Buffer工作溶液相应地裂解细胞。

1.3.1对于贴壁细胞:将Lysis Buffer工作溶液添加至培养板。有关建议的数量,请参见表1。

1.3.2对于非贴壁细胞:将细胞沉淀到离心管中,并向管中加入50-2000 μL Lysis Buffer工作溶液(取决于细胞沉淀的大小)。

1.4将上一步的细胞在室温下孵育10-15分钟,然后轻轻旋转平板或试管数次以确保完全裂解。

1.5继续进行FDG测定或将样品在-80°C下冷冻直至使用。注意:通过快速的冻融循环(在-20°C到-80°C冷冻1-2小时,然后在室温解冻)也可以获得良好的裂解。或者,将细胞裂解液离心2-3分钟以沉淀不溶物,然后测定上清液。

 

2.运行?-半乳糖苷酶测定

2.1如果需要,在室温下解冻裂解细胞管或板。如果细胞接种在96孔板上,则直接在96孔板上进行测定。

2.2在96孔板的每个孔中加入50 μL细胞提取物。如果需要标准曲线,请为标准曲线保存一些对照孔(50 uL /孔)。注意:如有必要,当转染效率很高时,可在裂解缓冲液工作溶液中稀释裂解液,或在转染效率低时减少裂解液的体积。如果在96孔板上进行转染,或将稳定的细胞系接种到96孔板上,请直接在板上进行测定。对于内源性β-半乳糖苷酶活性控制,请添加50 μL非转染细胞的细胞裂解液。对于空白对照,添加50 μL 1X裂解缓冲液。

2.3向每个孔中加入50 μL FDG工作溶液。根据细胞类型,将板在室温或37°C下孵育大约5分钟至4小时。

2.4向每个孔中添加50 μL终止缓冲液(组分C)。终止缓冲液除了终止反应之外,还引起产物的荧光强度增加。

2.5用荧光酶标仪在Ex / Em = 490/525 nm处测量每个孔中溶液的荧光强度。

2.6根据线性标准曲线定量?-半乳糖苷酶表达。

 

参考文献

BZLF1 Attenuates Transmission of Inflammatory Paracrine Senescence in Epstein-Barr Virus-Infected Cells by Downregulating Tumor Necrosis Factor Alpha
Authors: Xubing Long, Yuqing Li, Mengtian Yang, Lu Huang, Weijie Gong, Ersheng Kuang
Journal: Journal of Virology (2016): 7880--7893

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