Amplite 荧光法过氧化氢酶检测试剂盒 红色荧光是美国AAT Bioquest生产的用于检测过氧化氢酶 的试剂盒过氧化氢酶是一种常见的抗氧化血红素氧化还原酶，几乎在暴露于氧气的所有生物体中存在。酶在过氧化物酶体亚细胞器中浓缩。 过氧化氢是一种ROS，是正常有氧代谢和致病性ROS产生的毒性产物，涉及氧化酶和超氧化物歧化酶反应。 通过防止过量的H2O2积累，过氧化氢酶允许重要的细胞过程产生作为副产物的H2O2安全地发生。

Amplite 荧光过氧化氢酶分析试剂盒为过氧化氢酶活性的测量提供了一种快速而灵敏的方法。它可以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且无需分离步骤即可轻松适应自动化。过氧化氢酶与H2O2反应生成水和氧（O2）。Amplite Red还与H2O2反应生成红色荧光产物。因此，荧光强度的降低与过氧化氢酶活性成比例。用于测定的Amplite Red底物实现双重可记录模式。荧光信号可以通过Ex / Em = 540 / 590nm的荧光酶标仪或~576nm的吸光度酶标仪容易地读取。使用Amplite 荧光过氧化氢酶分析试剂盒，我们在100μL反应体积中检测到低至30 mU / mL的过氧化氢酶。

96孔板测定示例

概述

准备过氧化氢酶标准品和/或测试样品（50μL）

加入H₂O₂分析缓冲液（50μL）

在室温下孵育10-30分钟加入过氧化氢酶分析混合物（50μL）

在室温下孵育10-30分钟监测荧光增加 Ex / Em = 540 / 590nm

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

操作方法

1.准备库存解决方案：

1.1Amplite Red底物储备溶液（200X）：将65μLDMSO（组分F）加入到Amplite Red小瓶（组分A）中。 应立即使用原液，任何剩余的溶液需要等分并在-20°C冷冻。

注意：避免反复冻融循环，避免光照。

1.2100U / mL HRP储备溶液：将200μL测定缓冲液（组分C）加入到辣根过氧化物酶（组分D）的小瓶中。

注意：未使用的HRP原液应分成一次性等分试样并储存在-20°C。

1.310mM H₂O₂储备溶液：将10L 3％H₂O₂（0.88M，组分B）加入870L测定缓冲液（组分C）中。

注意：稀释的H₂O₂储备溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。

2.准备H₂O₂测定缓冲液：

将5μL10mMH₂O₂储备溶液（来自步骤1.3）加入5mL测定缓冲液（组分C）中。

3.准备连续稀释的过氧化氢酶标准品（0至2 U / mL）：

注意：在硫醇如DTT和β-巯基乙醇存在下，组分A是不稳定的。 硫醇的最终浓度高于10μM将显着降低测定动态范围。 NADH和谷胱甘肽（还原形式：GSH）可能干扰测定。

3.1将2μL1000U / mL过氧化氢酶标准品（组分E）加入1000μL测定缓冲液（组分C）中，得到2U / mL过氧化氢酶标准溶液。

3.2取500μL的2 U / mL过氧化氢酶标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到1,0.5,0.25,0.125,0.062,0.031和0 U / mL连续稀释的过氧化氢酶标准品。

3.3如表2和3中所述，将连续稀释的过氧化氢酶标准品和含过氧化氢酶的测试样品加入到固体黑色96孔微量培养板中。

4.运行过氧化氢酶测定：

4.1将50μLH₂O₂测定缓冲液（来自步骤2）添加到过氧化氢酶标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3）以使总过氧化氢酶测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLH₂O₂测定缓冲液。

4.2在室温下孵育反应15至30分钟，避光。

4.3根据下表制备测定混合物并避光：

4.4将50μL测定混合物（来自步骤4.3）加入过氧化氢酶标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总测定体积为150μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL测定混合物。

4.5在室温下孵育反应15至30分钟，避光。

4.6使用荧光板读数器监测Ex / Em = 540±10/590±10nm处的荧光增加（最佳Ex / Em = 540/590）。

注意：也可将板的内容物转移到白色透明底板中，并用吸光度酶标仪在5765nm波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

参考文献

In-Vitro and In-Vivo Antioxidant Activity of the Butanolic Extract from the Stem of Ephedra Alte
Authors: Bahaa Al-Trad, Mahmoud A Al-Qudah, Mazhar Al-Zoubi, Riyadh Muhaidat, Janti Qar
Journal: Biomedical and Pharmacology Journal (2018)