Cell Meter 细胞内荧光法过氧化氢检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测过氧化物 的试剂盒，过氧化氢 (H2O2) 是一种活性氧代谢副产物，是许多氧化应激相关状态的关键调节剂。它参与了许多与哮喘、动脉粥样硬化、糖尿病血管病变、骨质疏松症、许多神经退行性疾病和唐氏综合症有关的生物事件。也许过氧化氢生物学最有趣的方面是最近的报告，即抗体具有将分子氧转化为过氧化氢的能力，有助于免疫系统的正常识别和破坏过程。这种活性物质的测量将有助于确定氧化应激如何调节不同的细胞内途径。该 Cell Meter 过氧化氢检测试剂盒使用我们独特的 OxiVision Green 过氧化氢探针来量化活细胞中的过氧化氢。 OxiVision Green 具有细胞渗透性，当它与过氧化氢反应时会产生绿色荧光。该试剂盒是一种优化的“混合和读取”分析格式，与 HTS 液体处理仪器兼容。

96孔板的测定方案

概述

用于溶液测定

1.准备H₂O₂反应混合物（50μL）

2.加入H₂O₂标准品或测试样品（50μL）

3.在室温下孵育10-60分钟

4.在Ex / Em = 490/525 nm （cutoff=515nm）处检测荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

用于活细胞检测

1. 在生长培养基中制备细胞
2. 使用 OxiVision Green 过氧化氢探针工作溶液对细胞进行染色并孵育
3. 用测试化合物处理细胞
4. 在 Ex/Em = 490/525 nm (Cutoff = 515nm) 处用底部读取模式检测荧光强度

溶液配制

1. OxiVision Green 过氧化氢探针储备液 (250X)
将 50 μL DMSO（组分 D）加入 OxiVision Green 过氧化氢探针（组分 A）的小瓶中，制成 250X OxiVision Green 过氧化氢探针储备液，注意避光。
2. H2O2 标准溶液（20 mM）
将 22.7 μL 的 3% H2O2（0.88 M，组分 B）加入 977 μL 的 Assay Buffer（组分 C）中，制成 20 mM H2O2 标准溶液。
注意 稀释的 H2O2 标准溶液不稳定。 未使用的部分应丢弃。

3.H2O2 标准
将 50 μL 20 mM H2O2 标准溶液加入 950 μL Assay Buffer（组分 C）中，得到 1000 μM H2O2 标准溶液。 取 1000 μM H2O2 标准溶液并进行 1:3 的系列稀释，以得到含有测定缓冲液（组分 C）的系列稀释的 H2O2 标准品（HS1 - HS7）。

4.工作溶液配制

将 20 μL 250X OxiVision Green 过氧化氢探针储备液加入 5 mL 检测缓冲液（组分 C）中，制成 OxiVision Green 过氧化氢探针工作溶液。

操作步骤

在上清液反应中检测H2O2
表 1. 纯黑色 96 孔微孔板中 H2O2 标准品和测试样品的布局。 HS= H 2 O 2 标准品（HS1 - HS7，300 至 0.3 μM）； BL=空白控制； TS=测试样品

表2. 每孔试剂组成

1.根据表 1 和表 2 中提供的布局准备 H2O2 标准 (HS)、空白对照 (BL) 和测试样品 (TS)。对于 384 孔板，每孔使用 25 μL 试剂，而不是 50 μL。
2. 将 50 μL OxiVision Green 过氧化氢探针工作液加入 H2O2 标准品、空白对照和测试样品的每个孔中，使H2O2 测定总体积为 100 μL/孔。 对于384孔板，将 25 μL 的 OxiVision Green 过氧化氢探针工作溶液添加到每个孔中，总体积为 50 μL/孔。
3. 在室温下将反应孵育 15 到 30 分钟，避光。
4. 用荧光酶标仪在Ex= 490 ± 10，Em= 520 ± 10 nm（最佳 Ex/Em = 490/525 nm，截止 = 515 nm）检测荧光强度。

在活细胞中进行H2O2检测

1.根据需要培养细胞
2.用 PBS 缓冲液清洗细胞，用 100 μL/孔的 OxiVision Green 过氧化氢探针工作溶液孵育细胞 5 到 60 分钟。 对于 384 孔板，添加 25 μL/孔的 OxiVision Green 过氧化氢探针工作溶液。
3. 在 Ex/Em = 490/525 nm (Cutoff = 515 nm) 下使用荧光酶标仪（底部读取模式）检测荧光增加或使用 FITC 通道通过荧光显微镜成像荧光变化。

参考文献

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