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iFluor™460马来酰亚胺
物品单位 价格 品牌
2472 AAT Bioquest
  • 产地:American
  • 型号:1 mg
  • 货号:CS1058
  • 发布日期: 2022-03-01
  • 更新日期: 2022-03-29
产品详细说明
产地 American
品牌 AAT Bioquest
货号 CS1058
用途范围 Research Grade
纯度 98%%
CAS编号
规格 1 mg
是否进口
简要概述

AAT Bioquest的iFluor™染料针对标记蛋白质(特别是抗体)进行了优化。这些染料是明亮的,耐光的,并且对蛋白质的淬灭作用最小。尽管在许多新型荧光仪器中都安装了460 nm蓝光二极管激光器,但很少有染料可以在460 nm处被很好地激发。iFluor™460经过优化,可以被460 nm的蓝光二极管激光器很好地激发,从而为配备460 nm蓝光二极管激光器的新型荧光仪器实现了新的生物学应用。iFluor™460马来酰亚胺稳定,对硫醇基团具有良好的反应性和选择性。



产品说明书

样品分析方案 

储备溶液配制

1.蛋白质储备液(溶液A)
将100 μL反应缓冲液(例如1 M碳酸钠溶液或pH值为9.0的1 M磷酸盐缓冲液)与900 μL目标蛋白溶液(例如抗体,如果可能,蛋白浓度> 2 mg / mL)混合,得到1 mL蛋白质标记储备液。
注意:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0,请使用1 M碳酸氢钠溶液或1 M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH值调整为8.0-9.0。
注意:蛋白质应溶于pH 7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。如果将蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中,则必须使用pH 7.2-7.4的1X PBS进行透析,以去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)。
注意:如果蛋白质浓度低于2 mg / mL,结合效率会大大降低。为了获得最佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
 
2.染料原液(溶液B)
将无水DMSO加入iFluor™460 马来酰亚胺小瓶中,制成10-20 mM储备液。通过轻柔移液或涡旋混合均匀。
注意:开始缀合之前,请准备染料储备溶液(溶液B)立即使用。染料储备溶液的长时间储存可能会降低染料活性,避免冻融循环。
注意:收到后,iFluor™染料应储存在<-15°C的环境中,并远离光线和湿气。
注意:重新配制的iFluor™染料马来酰亚胺的DMSO储备溶液可以在<-15°C下保存长达4周。
注意:所需的蛋白质缀合物应在载体蛋白质(例如0.1%牛血清白蛋白)存在的情况下以> 0.5 mg / mL的浓度保存。当在2 mM叠氮化钠存在下存储时,缀合物溶液可以在4°C下存储两个月而无明显变化。为了更长的存储时间,可以将蛋白缀合物冻干或分成单份使用,并保存在≤-60°C下,并避光。

 

操作步骤

该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与iFluor™460 马来酰亚胺的缀合物而开发的,供参考。您的实际情况可能需要进一步优化您的特定蛋白质。
确定最佳的染料/蛋白质比率(可选)
每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比率,这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会不利地影响其结合亲和力,而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您使用一系列不同量的标记染料溶液,通过实验确定最佳的染料/蛋白质比率。通常,大多数染料-蛋白质缀合物推荐使用4-6种染料/蛋白质。
  1. 以溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的10:1摩尔比为起点:将5 μL染料储备溶液(溶液B,假定染料储备溶液为10 mM)添加到蛋白质瓶中。溶液(95 μL溶液A)有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg / mL,蛋白质的分子量为?200KD,则蛋白质的浓度约为0.05 mM。
    注意:蛋白质溶液中DMSO的浓度应小于10%。
  2. 进行缀合反应。
  3. 重复步骤2,溶液B /溶液A的摩尔比为5:1;15:1和20:1。
  4. 使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。
  5. 计算上述4种缀合物的染料/蛋白质比率(DOS)。
  6. 对以上4种缀合物进行检测,以确定最佳的染料/蛋白质比率,以扩大标记反应的范围。 

进行缀合反应
  1. 在有效摇动下,将适量的染料储备溶液(溶液B)添加到蛋白质溶液(溶液A)的小瓶中。
    注意:溶液B /溶液的最佳摩尔比由上述步骤确定。如果跳过该步骤(本节:确定最佳的染料/蛋白质比),我们建议使用溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的摩尔比为10:1。
  2. 在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。 

纯化
以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化染料-蛋白质缀合物的示例。
  1. 准备Sephadex G-25色谱柱。
  2. 将反应混合物(步骤的最后一步:进行缀合反应后的混合物)加载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。
  3. 样品刚好在顶部表面下方流动时,立即添加PBS(pH 7.2-7.4)。
  4. 向所需样品中添加更多PBS(pH 7.2-7.4),以完成柱纯化。
    注意:为了立即使用,染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释,并分装多次使用。
    注意:为了长期保存,染料-蛋白质结合物溶液需要浓缩或冷冻干燥(见下文)。 

 

 

参考文献

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