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iFluor 720琥珀酰亚胺酯
物品单位 价格 品牌
3612 AAT Bioquest
  • 产地:American
  • 型号:1 mg
  • 货号:CS1046
  • 发布日期: 2022-03-01
  • 更新日期: 2022-03-29
产品详细说明
产地 American
品牌 AAT Bioquest
货号 CS1046
用途范围 Research Grade
纯度 98%%
CAS编号
规格 1 mg
是否进口
简要概述

iFluor 720琥珀酰亚胺酯是iFluor系列荧光标记染料之一,可以覆盖整个可见光谱。所有iFluor 染料都具有优异的水溶性,它们的亲水性使有机溶剂的使用极小化。与常规的染料(如FITC,TRITC,Texas Red ,Cy3 ,Cy5和Cy7)相比,iFluor 染料具有更好的标记性能。一些iFluor 染料在某些抗体上明显优于Alexa Fluor 标记染料。它们是用于标记蛋白质和核酸的极便宜的荧光染料(替代Alexa Fluor 染料)。每种iFluor染料的开发都与特定的Alexa Fluor 或其他标记染料(如DyLight 染料)的光谱特性相匹配。

琥珀酰亚胺基(NHS)酯被证明是用于胺修饰的极佳试剂,因为形成的酰胺键基本上与天然肽键相同并且稳定。这些试剂通常是稳定的并且与脂族胺显示出良好的反应性和选择性。当琥珀酰亚胺酯化合物用于缀合反应时,需要考虑的因素很少:1.溶剂:在大多数情况下,活性染料应溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中。 2.反应pH:胺与琥珀酰亚胺酯的标记反应强烈依赖于pH。胺反应性试剂与非质子化脂族胺基团反应,包括蛋白质的末端胺和赖氨酸的β-氨基。因此,胺酰反应通常在pH 7.5以上进行。被琥珀酰亚胺酯修饰的蛋白质是具有代表性的,通常在pH 8.5-9.5下合成。 3.反应缓冲液:使用胺反应试剂时,必须避免使用含有游离胺(如Tris和甘氨酸)和硫醇化合物的缓冲液。广泛用于蛋白质沉淀的铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)也必须在进行染料缀合之前除去(例如通过透析)。 4.反应温度:大多数缀合在室温下进行。特定标记反应可能需要升高或降低的温度。iFluor系列染料 是AF系列染料的完美替代品。



产品说明书

染色样本分析

溶液配制

1.蛋白质原液配制(溶液A)

将100μL反应缓冲液(如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液,pH~9.0)与900μL目标蛋白溶液(如抗体,蛋白质浓度> 2 mg / ml,如果可能)混合至100μL,再加入1 mL蛋白质标记原液。

注1:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0,则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注2:蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中,则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析,以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)。

注3:不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白(BSA)抗体或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞,以获得极佳标记结果。

注4:如果蛋白质浓度低于2 mg / mL,则结合效率会显着降低。为获得极佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

2.iFluor 720琥珀酰亚胺酯原液配制

将无水DMSO加入到iFluor 720 SE小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

注意:在开始缀合前准备染料储备溶液(溶液B),及时使用。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周,避光保存。 避免冻融循环。

 

操作步骤 

该标记方案是为山羊抗小鼠 IgG 与 iFluor 720 SE 的结合而开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。 注意 每种蛋白质需要不同的染料/蛋白质比例,这也取决于染料的特性。蛋白质的过度标记会对其结合亲和力产生不利影响,而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。 

1.进行缀合反应:

1.1使用 10:1 的溶液 B(染料)/溶液 A(蛋白质)的摩尔比作为起点:将 5 μL 染料储备溶液(溶液 B,假设染料储备溶液为 10 mM)添加到蛋白质小瓶中溶液(95 μL 溶液 A)有效摇动。假设蛋白质浓度为 10 mg/mL 且蛋白质的分子量为 ~200KD,则蛋白质的浓度为 ~0.05 mM。

注意:我们建议使用 10:1 摩尔比的溶液 B(染料)/溶液 A(蛋白质)。如果太低或太高,分别确定最佳染料/蛋白质比例为 5:1、15:1 和 20:1。

1.2在室温下继续旋转或摇动反应混合物 30-60 分钟。

 

2.纯化缀合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 - 蛋白质缀合物的实例。

2.1按照制造说明准备Sephadex G-25色谱柱。

2.2将反应混合物(直接从步骤4)加载到Sephadex G-25柱的顶部。

2.3样品在顶部树脂表面下方运行时立即加入PBS(pH 7.2-7.4)。

2.4向所需样品中加入更多PBS(pH 7.2-7.4)以完成色谱柱纯化。

注1:立即使用时,染料 - 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释,并等分多次使用。

注2:对于长期储存,染料 - 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 

参考文献

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