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FITC-xtra 异硫氰酸荧光素
物品单位 价格 品牌
2604 AAT Bioquest
  • 产地:American
  • 型号:5 mg
  • 货号:CS135
  • 发布日期: 2022-03-01
  • 更新日期: 2022-04-01
产品详细说明
产地 American
品牌 AAT Bioquest
货号 CS135
用途范围 Research Grade
纯度 98%%
CAS编号
规格 5 mg
是否进口
简要概述

FITC-xtra 异硫氰酸荧光素是美国AAT Bioquest生产的荧光素 ,虽然FITC是用于制备绿色荧光生物共轭物的最流行的荧光标记染料,但是FITC存在某些限制,例如用于显微镜成像的严重光漂白和pH敏感荧光。与相应的FITC缀合物相比,用FITC-xtra制备的蛋白质缀合物是非常优秀的。FITC-xtra缀合物比FITC缀合物明显更亮,并且更加光稳定。另外,FITC-xtra的荧光不受pH(4-10)的影响。这种pH不敏感性是对FITC的重大改进,FITC仅在pH大于9时才发出其最大荧光,FITC-xtra具有几乎相同FITC的光谱特性。此外,FITC-xtra在温和缀合条件下比FITC产生高得多的缀合产率。像5-FITC,FITC-xtra抗体缀合物适合于488nm激光线的激发,使其成为相应的FITC标记的抗体缀合物的替代物。在检测条件相同的情况下,FITC-xtra抗体缀合物提供比相应的FITC标记的缀合物高得多的信号/背景比。



产品说明书

实验方案

1.准备蛋白质储备溶液(溶液A):

将100μL反应缓冲液(例如,1M碳酸钠溶液或1M磷酸盐缓冲液,pH~9.0)与900μL目标蛋白溶液(例如抗体,蛋白质浓度> 2 mg / ml,如果可能)混合,得到1 mL蛋白标记储备液。 
注1:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0,则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。 
注2: 应将蛋白质溶于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中,则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析,以除去用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)。 
注3:若使用不纯的抗体、牛血清蛋白(BSA)和明胶稳定的抗体,则标记效果不会特别好。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞,以获得最佳标记结果。 
注4:如果蛋白质浓度小于2mg / mL,则缀合效率明显降低。为获得最佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
 
2.准备染料储备溶液(溶液B):
将无水DMSO加入到FITC-xtra小瓶中以制备10-20mM储备溶液,通过移液或涡旋混合均匀。 
注:在开始缀合之前准备染料储备溶液(溶液B)随配随用,保证使用的溶液的新鲜。染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。溶液B可以在不受光照和潮湿的情况下储存在冰箱中两周。
 
3.准备所需的蛋白质缀合物: 
注:每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例,这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能对其结合亲和力产生不利影响,而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定最佳染料/蛋白质比率。通常,对于大多数染料 - 蛋白质缀合物,推荐使用4-6种染料/蛋白质。
 
3.1使用10:1摩尔比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)作为起始点:将5μl染料储备溶液(溶液B,假设染料储备溶液为10 mM)加入到蛋白质的小瓶中溶液(95μl溶液A),有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD,蛋白质的浓度为~0.05mM。 
注意:蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10%。
3.2进行缀合反应。在有效摇动下将适量的染料储备溶液(溶液B)加入到蛋白质溶液(溶液A)的小瓶中。继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
3.3重复#3.2,溶液B /溶液A的摩尔比为5:1; 如果需要,分别为15:1和20:1。
3.4使用预制的旋转柱或其他技术纯化所需的缀合物。
3.5计算上述4种缀合物的染料/蛋白质比(DOS)。
 
 
参考文献

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Authors: Yan Chen, Ji Sun, Ying Lu, Chun Tao, Jingbin Huang, He Zhang, Yuan Yu, Hao Zou, Jing Gao, Yanqiang Zhong
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Authors: Liyan Ping, Jan Birkenbeil, Shamci Monajembashi
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