产品概述

T4 DNA Ligase可催化dsDNA平末端或粘性末端相邻核酸的5'磷酸末端和3'羟基末端形成磷酸二酯键，还可催化RNA和双链中的ssDNA或RNA链连接，但不能催化全单链核苷酸连接。适用于标记RNA 3'-末端，环化RNA和DNA寡聚核苷酸以及克隆cDNA等核酸操作。

产品组分

组 分 CE1106 (40,000 U)

T4 DNA Ligase (400 U/μl) 100 μl

保存条件

-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。

适用范围

1. DNA-片段和载体DNA的连接。

2. DNA-片段和Linker或Adaptor DNA的连接。

单位定义

在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-HindⅢ的分解物在16℃下反应30 min时，有50%以上的DNA-片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。

反应过程

1、在微量离心管中制配制连接反应体系：

灭菌蒸馏水 To 10 μl

10 × Ligase Buffer                      1 μl

插入片段^a 0.3 pmol

载体DNA^b 0.03 pmol

T4 DNA Ligase (400 U/μl) 1 μl

a:插入片段与载体的摩尔比应在3:1 - 10:1之间。

B:平末端载体与DNA-片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。

2、16℃过夜反应

3、连接产物转化

① 在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞(如：DH5α Competent cell)。

② 取10 μl连接产物加入到100 μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30 min。

▲ 连接产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10。

③ 42℃水浴热激45 sec后，立即置于冰上冷却2 - 3 min。

④ 加入900 μl SOC或LB培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1 h(200 - 250 rpm)。

⑤ 将相应抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。

⑥ 5,000 rpm(2,400 × g)离心5 min，弃掉900 μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。

⑦ 37℃培养箱中倒置培养12 - 16 h。