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| 产地 | China |
| 品牌 | Chemstan |
| 货号 | CSRT0912 |
| 用途 | Research Grade |
| 包装规格 | 10KU |
| 纯度 | >95% as determined by SDS-PAGE% |
| CAS编号 | |
| 是否进口 | 否 |
产品概述
Reverse TranscriptaseⅢ是通过体外大肠杆菌表达体系分子进化技术筛选获得的全新逆转录酶，与原始逆转录酶相比，其 cDNA 合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达 60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的 RNA 模板的逆转录。同时，该酶增强了与 模板的亲和力，非常适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Reverse TranscriptaseⅢ合成全长cDNA 的能力也有了提升，可扩增长达19.8 kb的cDNA。
产品组分
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组 分 |
CSRT0912 (10,000 U) |
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Reverse TranscriptaseⅢ (200 U/μl) |
50 μl |
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5×BufferReverse TranscriptaseⅢ Buffer |
250 μl |
保存条件
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。
适用范围
全长 cDNA 文库构建；终点法 PCR；实时定量 PCR 等。
单位定义
以Poly(rA)·Oligo(dT)为模板/引物，在37℃，10 min条件下，掺入1 nmol的dTTP为酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。
注意事项
请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase-free。
第一链 cDNA 合成操作步骤
1. RNA 变性（此步为可选步骤，RNA 变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链 cDNA 的产量。）
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组 分 |
用量 |
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RNase-free H2O |
to 13 μL |
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Oligo (dT)18 (50 μM) |
1 μL |
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or Random Primers (50 μM) |
or 1 μL |
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or Gene Specific Primers (2 μM) |
or 1 μL |
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模板 RNA |
Total RNA: 10 pg -5 μg 或 mRNA:10 pg-500 ng |
65℃加热 5 min，迅速置于冰上冷却 2 min。简短离心收集反应液后加入下表中的逆转录反应液，并用移液器轻轻吹打混匀。
2. 逆转录反应体系配制（20 μL 体系）
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组 分 |
用量 |
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上一步的反应液 |
13 μL |
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5×BufferReverse TranscriptaseⅢ Buffer |
4 μL |
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dNTP Mix (10 mM) |
1 μL |
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Reverse TranscriptaseⅢ (200 U/μl) |
1 μL |
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RNase inhibitor (40 U/μL) |
1 μL |
3. 逆转录程序设置
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温度 |
时间 |
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25℃ |
5 min |
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55℃ |
15-30min |
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85℃ |
85℃ |
【注】：1）当使用 Random Primers 时，需 25℃，孵育 5 min；若使用 Oligo (dT)18 或 Gene Specific Primers，此步可省略；
2）逆转录温度：推荐使用 55℃；对于高 GC 含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到 60℃；
3) 可将逆转录时间延长到 45-60min，有助于提高产量；
4）85℃加热 5 min，目的是使逆转录酶失活。
※ 逆转录产物可立即用于后续 PCR 或 qPCR 反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
