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质粒DNA小量提试剂盒
物品单位 价格 品牌
280 Chemstan
  • 产地:China
  • 型号:100 次
  • 货号:CSDE0301
  • 发布日期: 2022-05-11
  • 更新日期: 2022-05-13
产品详细说明
产地 China
保存条件 室温储存
品牌 Chemstan
货号 CSDE0301
检测方法
CAS编号
保质期 12 个月
规格 100 次
适应物种
检测限
数量
用途范围 Research Grade
标记物
纯度 %
样本
应用
是否进口

1. 试剂盒储存、稳定性:


稳定性

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。

储存事项:
1). RNase A 保存在即用型甘油缓冲液中,常温运输,不超过 25℃室温至少保存 6个月,4℃保存 12 个月,长期保存放-20℃。


2). 第一次使用时,将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后(终浓度100ug/ml)置于 2-8℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活,提取的质粒可能会有微量 RNA残留,在溶液 P1 中补加 RNase A 即可。
3). 环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出浑浊或者沉淀,可在 37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。

4). 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。


2. 产品介绍:
本试剂盒采用改进 SDS-碱裂解法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。
3. 产品特点:
1). 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。
2). 独有的去蛋白液配方,可以高效去除残留的核酸酶,即使是核酸酶含量丰富的菌株如 JM 系列、HB101 也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。
3). 快速、方便,不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好,可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
4. 注意事项
1). 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2). 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒,建议接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基,过夜培养14-16个小时,可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应适当加大菌体使用量,使用5-10 ml过夜培养物,同时按比例增加P1、P2、P3的用量,其它步骤相同。

3). 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。

4). 质粒DNA确切分子大小,必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的质粒,泳动位置不确定,无法通过电泳知道其确切大小。
5). 洗脱液Elution Buffer不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
5. 关于平衡液的使用
1). 介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至 37℃使沉淀完全消失。
2). 使用方法:取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中,吸取 100μl 的平衡液至柱子中。13000 rpm 离心 1 分钟,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。
6. 操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:
※ 第一次使用前请先在漂洗液 Wash Buffer 和去蛋白液 DW 瓶中加入指-定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
※ 将 RNase A 全部加入溶液 P1 中,混匀,每次使用后置于 2-8℃保存。
1).取 1.5-4.5 ml 过夜培养的菌液,12,000rpm 离心 30 秒,尽可能的倒干上清,收集菌体。

※ 收集超过 1.5 ml 菌液,可以离心弃上清后,在同一个 1.5ml 管内加入更多的菌液,重复步骤 1,直到收集到足够的菌体。


2). 用 250μl 溶液 P1 重悬菌体沉淀,涡旋振荡至彻底悬浮。
※ 如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
3). 加 250μl 的溶液 P2,温和地上下翻转 6 -8 次使菌体充分裂解,室温放置 4 分钟。
※ 温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组 DNA 剪切断裂!所用时间不应超过 5 分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的 5 分钟。
4). 加 350μl 溶液 P3,立即温和地上下翻转 6 -8 次,充分混匀时会出现白色絮状沉淀。12,000rpm 离心 10 分钟,小心取上清。
※ 加入溶液 P3 后应该立即混匀,以免产生 SDS 的局部沉淀。
平衡液预处理吸附柱:
使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见前文“关于平衡液的使用”
5). 将上一步所得上清加入吸附柱 AC 中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm 离心30-60 秒,倒掉收集管中的废液。
6). 可选步骤::加入 500μl 去蛋白液 DW,12,000rpm 离心 30 秒,弃废液。此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质,如所用菌株为 JM 系列、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株,核酸酶含量丰富,应加此步骤;如所用菌株为 XL-1 Blue、Top10和 DH5α 等缺陷型菌株,核酸酶含量低,则可略过此步骤。
7). 加入 600μl 漂洗液 Wash Buffer(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心 30 秒,弃掉废液。
8). 加入 600μl 漂洗液 Wash Buffer,12,000rpm 离心 30 秒,弃掉废液。
9). 将吸附柱 AC 放回空收集管中,12,000rpm 离心 2 分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10). 取出吸附柱 AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加 50-100μl洗脱缓冲液 Elution Buffer(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置 2 分钟,12,000rpm 离心 1 分钟。如果需要较多量质粒,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心 1 分钟。
※ 洗脱体积越大,洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于 30μl,体积过小降低质粒洗脱效率,减少质粒产量。








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