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BOLAZfast Single One-Step Cloning kit
物品单位 价格 品牌
980 Chemstan
  • 产地:China
  • 型号:50 rxn
  • 货号:CSCE1101
  • 发布日期: 2022-05-11
  • 更新日期: 2022-05-13
产品详细说明
产地 China
保存条件 -20 °C 储存
品牌 Chemstan
货号 CSCE1101
检测方法
CAS编号
保质期
规格 50 rxn
适应物种
检测限
数量
用途范围 Research Grade
标记物
纯度 %
样本
应用
是否进口

1、产品简介

BOLAZfast “一步法快速克隆试剂盒”可用于无缝克隆外源澳 DNA 片段:简单、快速、高效。该方法不依赖于任何限制性内切酶,可将任何外源澳 DNA 片段定向克隆至任意载体的任意位点(特殊情况,如有毒基因的克隆或插入外源DNA后导致质粒本身不稳定等除外)。因此,在基因克隆、DNA 拼接和澳DNA 定点突变等领域有广泛用途。

2、产品组成

组分                                                                                             CSCE1101(50 rxn)

2 × BOLAZfast Single One-Step Cloning kit                                              500 μL

Control (1:1): 4-kb vector + 2.2-kb insert (50 ng/μL)                                 5 μL

注:阳性对照载体为 Amp 抗性。
3、产品保存

本产品应置于-20 °C 储存,并在使用时注意保持低温(如置于冰上)。

4、使用说明
4.1 制备线性化载体
在靶标载体上选择合适的克隆位点,对克隆载体进行线性化处理。如果可以选择的话,建议尽量选择无重复序列、无高级结构且 GC 含量在 40%~65%之间的区域用于外源 DNA 的克隆。常用的载体线性化方法包括:限制性内切酶酶切和设计反向引物进行 PCR 扩增制备。
4.2 酶切法制备线性化克隆载体
如果有合适的酶切位点,建议使用该方法,整个操作流程也比较简单。其中,双酶切比单酶切更好。酶切后,可以取少量酶切产物进行电泳,以确保全部载体被切开。对于绝大部分酶,可以对酶切产物进行 65° C 高温 20 min 灭活,然后直接用于后续无缝拼接反应,而无需对酶切的载体进行胶回收或过柱回收等处理。
4.3 设计反向引物进行 PCR 扩增制备
建议使用高保真 DNA 聚合酶进行载体的扩增(如博雷兹生物科技的 FastPfu 酶等)以降低 PCR 扩增过程中引入的突变率。本试剂盒与常规 PCR 的反应体系兼容;因此,如果 PCR 产物条带单一,则可直接用于后续的重组反应(注:线性化载体作为模板时无需去除;而环形载体需要去除。如

载体有甲基化,则可使用 DpnI 进行酶切去除)。反之,如果 PCR 扩增产物的纯度较低,则应将PCR 产物进行电泳后用胶回收进行纯化。

4.4 设计用于扩增外源 DNA 片段的引物
通过在引物的 5’端引入与线性化克隆载体末端一致的 DNA 序列,长度在 15-20 bp 之间。
4.5 进行重组反应
4.6 反应产物转化
上述反应液可以直接用于感受态转化(一般为大肠杆菌感受态)。热激法转化流程:将反应液加到 100-200 μL 感受态细胞中,混匀后于冰上放
置 30 min;42 °C 热激 90 秒,冰水浴孵育 2 min;加入 800 μL SOC 或 LB 培养基,于 37 °C 摇床孵育 45 min。取适量(10-100 μL)菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置于 37 °C 培养箱过夜培养。 平板上长出的克隆可以使用“菌落 PCR 的方法”进行快速鉴定(或者“质粒快速抽提的方法”)。针对阳性克隆,可根据实验需求 进行进一步的序列测定。
5、阳性对照
使用阳性对照,载体(4 kb)和 1 个外源 DNA 片段(2.2 kb)进行无缝拼接,长出的克隆利用菌落PCR 的方法进行验证,正确的目的条带大小应该为 2.2 kb 左右。从图 2 中可以看出,随机挑选的 20个克隆全部正确(100%阳性率)。随后对上述阳性克隆进行两端 DNA 测序;测序结果表明,阳性克隆的序列全部正确。


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