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Fast T4 DNA Ligase
物品单位 价格 品牌
500 Tolo Bio
  • 产地:China
  • 型号:100 μL
  • 货号:32214
  • 发布日期: 2022-06-13
  • 更新日期: 2022-06-14
产品详细说明
产地 China
品牌 Tolo Bio
货号 32214
用途范围 Research Grade
纯度 %
CAS编号
规格 100 μL
是否进口

产品简介

Fast T4 DNA Ligase 是基于 T4 DNA Ligase 改造的快速连接酶,能够催化双链 DNA 或 RNA 上相邻的 5′-磷酸末端和 3′-羟基末端形成磷酸二酯键。本试剂盒不仅适用于黏性末端连接,也兼容平滑末端和单碱基突出末端的 DNA 连接, 优化的连接增强剂及反应缓冲液使反应更加高效便捷,室温(25℃)反应 5 min 即可完成连接反应,连接产物也可 直接转化多种化学感受态细胞。

产品组成

组分
CS32214-01
CS32214-02
Fast T4 DNA Ligase (400 U/μL)
100 μL
1 mL
2 × Fast T4 DNA Ligase buffer
1 mL
10 × 1 mL

单位定义

在 20 μL 的连接反应体系中,6 μg 的 λDNA-HindIII 的分解物在 16℃下反应 30 分钟时,有 50%以上的 DNA 片段被 连接所需要的酶量定义为 1 个 活性单位 (U)。

质量控制

核酸外切酶残留检测:将 2000 U 连接酶和 0.6 μg λ-Hind III 在 74℃下反应 1 小时,DNA 的电泳谱带不发生变化。 核酸内切酶残留检测:将 2000 U 连接酶和 0.6 μg 超螺旋 pUC18 DNA 在 74℃下反应 1 小时,DNA 电泳谱带不发生 变化。

存储条件

-20 ℃保存。

实验流程

1、连接反应

1)于冰上配置如下反应体系

2 × Fast T4 DNA Ligase buffer
10 μL
载体
0.03 pmol (即 20 ng/ kb 载体长度)
片段
0.03-0.3 pmol (最适为 60 ng/ kb 外源长度)
Fast T4 DNA Ligase
1 μL
ddH2O
To 20 μL
(例如,将 1 kb 的外源片段克隆至 4 kb 的克隆载体时,克隆载体的最适使用量为: 20 ng × 4 = 80 ng;插入片段 的最适使用量为:60 ng × 1 = 60 ng。)

2)使用移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀),短暂离心将反应液收集至管底。

3)反应条件:25℃反应 5min;降至 4℃或立即置于冰上冷却。当进行平滑末端或 TA 连接时, 可适当延长反应时间以提高连接效率,但建议不超过 2 h。

a.若使用 4℃或 16℃进行连接,则建议连接过夜;

b.连接产物若需要电转化感受态细胞,则需将连接产物进行柱回收或乙醇沉淀法等处理以除去反应液中的大量离子。

c.连接产物可于-20℃冻存一周,待需要时解冻转化即可。

2、连接产物转化

1)将克隆用的化学感受态细胞置于冰上解冻

2)取 5 - 10 μL 连接产物加入 100 μL感受态细胞中,轻轻混匀,冰上静置 30 min。

a. 连接产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的 1/10;且切勿使用振荡混匀。

3)42℃水浴热激 90 sec 后,立即置于冰上冷却 2 - 3 min。

4)加入 900 μL SOC 或 LB 液体培养基 (不添加抗生素),37℃摇菌复壮 45 min。 5)将复壮后的菌液用 5,000 rpm离心 5 min,弃掉 900 μL上清,并用剩余培养液将菌体重悬;用 无菌涂布棒将菌液涂布在含有正确抗性的平板上,于 37℃培养箱中倒置培养 12 - 16 h。

3、阳性克隆鉴定

菌落 PCR 鉴定;酶切鉴定;质粒鉴定;测序分析。


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