Hi-Efficienct Cloning Mix（一步法无缝克隆试剂盒）

说明书

产品信息 Products

产品描述 Product overview

基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25 nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。

Hi-Efficienct Cloning Mix为2×重组Mix，一次反应可完成单至多个DNA片段的重组， 仅需5分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于95%。Cloning Mix中添加的辅助因子，有效提高克隆阳性率，经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯化PCR产物中含有的杂质，在克隆阳性率与兼容性方面有着优异的表现。

运输与保存方法 Transportation and preservation methods

冰袋运输；-20℃保存，有效期2年；建议 次使用时分装冻存，避免反复冻融。

使用方法 Usage method

1. 克隆载体的线性化

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向PCR扩增完成。

1）酶切制备

使用限制性内切酶进行载体线性化时，推荐使用双酶切方法进行，其次是单酶切。推荐使用快速内切酶，使载体线性化完全，可以适当延长酶切时间减少环状质粒模板残留，以降低转化背景（假阳性克隆）。

注1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化；

注2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或将目的产物进行纯化后再用于重组反应。

2）反向PCR扩增制备线性化载体：

反向PCR扩增制备线性化载体时为了减少扩增突变的引入，推荐使用高保真PCR Mix进行扩增，推荐使用预线性化的质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

注：以环状质粒为模板时，PCR产物需要使用DpnI等甲基化敏感型限制性内切酶对扩增产物进行处理，或对产物进行胶回收纯化。

2. 目的片段的获取

1）目的片段PCR引物设计

通常使用PCR扩增的方法来获得目的片段，PCR引物的5'端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25 nt（推荐18 nt）序列,以保证扩增产物的5'端和3'端分别与相邻片段形成重叠序列。目的片段PCR引物包括：载体与插入片段连接处引物、插入片段与片段连接处引物。

所得线性载体的两端因线性方式（双酶切、单酶切、反向PCR扩增等）不同，分为三种末端结构的任意组合，插入片段的特异性引物的设计仍然遵循通常引物设计的原则。

方案一：克隆载体使用单酶切或者双酶切

方案二：克隆载体使用反向PCR扩增

方案三：多片段引物设计方案

注1：尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25 nt区域内GC含量为40%~60%时，重组效率 ；

注2：最终的PCR引物长度如果超过40 nt，推荐在引物合成时选用PAGE纯化。

2）目的片段的PCR扩增

推荐使用高保真PCR Mix进行插入片段的扩增，以减少突变的引入。

注：PCR产物建议纯化后再进行重组反应；若PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可以直接使用，但加样体积不应超过2 μl（总反应体积的20%）。

3. 重组反应

1） 实验流程

2）线性化载体和插入片段的浓度测定

进行载体和插入片段的浓度测定时，若线性化载体与插入片段已经过纯化，且经电泳检测条带单一或无Smear残留时，可使用超微量核酸蛋白检测仪等基于分光光度法的仪器进行浓度测定，当A260/A280在1.8~2.0之间时浓度值可信；若线性化载体与插入片段未经过纯化，也可以使用琼脂糖电泳测定样品浓度。

3）于冰水浴中配制以下反应体系：

a.最适载体用量 (ng) = 0.02×载体碱基对数，即0.03 pmol（单片段、多片段适用）；

b.最适片段用量（ng）= 0.04×片段碱基对数（单片段）；最适片段用量（ng）= 0.02 ×片段碱基对数（多片段）。

注1:单片段重组反应，若单个插入片段的长度大于载体，则应将载体与插入片段的计算公式互换；

注2:单片段重组反应，若单个插入片段的长度小于200 bp，则插入片段应使用5倍的用量；

注3:多片段重组反应，各个插入片段的用量应不少于10 ng，使用上述公式计算最适使用量低于此值时直接使用 10 ng；

注4:若按上述公式计算出的线性化载体用量低于50 ng或高于200 ng，建议按50 ng或200 ng用量使用；

注5:线性化载体过长，插入片段过长或片段数过多，克隆阳性率均会降低。

重组反应体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。

4）将反应体系置于50℃，反应5~60min

注1:推荐使用PCR仪等温控精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低；

注2:插入1~2个片段时，推荐反应时间为5~15min（建议15 min）；插入3~5个片段时，推荐反应时间为15~30 min（建议30 min）；

注3:当载体骨架在10 kb以上或插入片段总长在4 kb以上时，推荐延长反应时间至30~60min；

注4:建议在50°C反应完成后进行瞬时离心，将反应液收集至管底。

5）将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20°C

注: -20°C储存的重组产物，建议1周内使用完毕。

4. 重组产物转化

1）将克隆用的化学感受态细胞置于冰上解冻；

2）取5~10 μl重组产物反应液，加入到100 μl感受态细胞中，缓慢吸打混匀，冰上放置30 min ；

3）42°C热激45~60 sec，冰浴5 min；

4）加500 μl SOC或LB培养基，37°C振荡培养40~60 min (200 rpm)；

5）将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于37°C过夜培养。

注1:推荐使用转化效率>10⁸CFU/g的感受态细胞；

注2:菌落数取决于PCR产物与线性化载体的数量和纯度。

5. 阳性克隆鉴定

1）菌落PCR法

挑取单菌落至10 μl ddH₂O中混匀，95°C裂解10 min后，取1 μl裂解液作为模板使用合适的正、反向引物进行菌落PCR鉴定。

注:菌落PCR时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果。

2）酶切法

挑取单菌落接种至合适抗性的液体培养基中过夜培养后，提取质粒进行酶切鉴定。

3）测序鉴定

使用载体的通用引物测序，进行序列分析。

注意事项 Matters need attention

1.单次完成多个插入片段或者重组质粒的长度较长时，推荐使用高效率感受态细胞进行重组产物转化；

2.若使用未纯化的PCR扩增产物进行重组反应时，加样体积不应超过2 μl (总反应体积的20%) ；

3.以质粒为模板进行插入片段PCR扩增时，若后续使用DpnI消化处理，应在反应完成后失活 DpnI，以免降解重组载体。

常见问题 Frequently asked question