产地 | 中国 |
品牌 | chemstan |
货号 | YMM-04005H |
用途 | 科研用途 |
包装规格 | mL×5 |
是否进口 | 否 |
ChemStart SYBR Green qPCR Mix(化学染料法荧光定量PCR预混液)
(None Rox)说明书
产品信息 Products
产品名称 |
产品编号 |
规格 |
ChemStart SYBR Green qPCR Mix(None Rox) |
YMM-04005H |
1mL×5 |
产品描述 Product overview
ChemStart SYBR Green qPCR Mix(None Rox)染料法荧光定量PCR专用预混液是使用SYBR Green I 嵌合荧光法进行qPCR的专用试剂。其基于化学热启动Taq DNA 聚合酶,配合针对qPCR优化的合适Buffer,可以有效抑制非特异扩增,适用于进行高特异性的qPCR 反应。使用本品进行qPCR反应,可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对靶基因进行准确定量、检测,重复性好,可信度高。
使用方法 Usage method
1.适配机型
Bio-Rad CFX 全系列 |
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 系列 |
Roche LightCycler™ 系列 |
Takara Thermal Cycler Dice |
Eppendorf Mastercycler® ep realplex 系列 |
analytikjena qTOWER 系列等 |
2.使用注意
① 因Mix中预混有染料,其保存或反应体系配制过程应避免强光照射;
② 使用前上下颠倒轻轻混匀Mix,请勿涡旋振荡混匀,避免产生过多气泡。
3.建议的qPCR反应体系
试剂 |
使用量 |
终浓度 |
ChemStart SYBR Green qPCR Mix(None Rox) |
10 μL |
1× |
正向引物 (10 μM)a |
0.4 μL |
0.2 μM |
反向引物 (10 μM)a |
0.4 μL |
0.2 μM |
DNA模板 b |
× μL |
10~200 ng/20 μL |
a.通常推荐的引物终浓度为0.2 μM,反应效果不佳时可在0.1~1 μM范围内进行调整。
b.推荐模板加样量为1~2 μL,如模板类型为未稀释cDNA原液,模板添加量不应超过总反应体系的10%。不同种类DNA模板中含有的靶基因拷贝数目不同,必要时可以进行梯度稀释,以确定 的DNA模板添加量。
4.qPCR反应程序(可根据机型适当调整)
两步法
步骤 |
温度 |
时间 |
预变性 a |
95℃ |
10 min |
变性 |
95℃ |
10 sec |
退火&延伸 a |
60℃ |
30 sec |
熔解曲线 b |
使用仪器默认采集程序 |
40 Cycles
三步法
步骤 |
温度 |
时间 |
预变性 |
95℃ |
10 min |
变性 |
95℃ |
10 sec |
退火a |
55~65 ℃ |
10 sec |
延伸a |
72℃ |
30 sec |
熔解曲线 b |
使用仪器默认采集程序 |
40 Cycles
a. 根据引物的Tm值进行退火(退火&延伸)温度的设定;若扩增片段在200 bp以内,延伸(退火&延伸)时间可以设置为15 sec;以外,延伸时间的设置还需根据您使用的qPCR仪所需要的数据采集 时间限制自行调整;
b.不同qPCR仪的熔解曲线采集程序有差别,一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。
5.实验优化
若使用默认反应条件反应性能不佳时,则需要进行反应条件的优化,可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行:
引物浓度调整
当引物终浓度在0.1~1.0 μM范围之间变化时,引物浓度越低,扩增特异性越高,但扩增效率会有所下降。
扩增程序优化
需提高扩增特异性,可使用两步法程序或提高退火温度;需提高扩增效率,可使用三步法程序或延长延伸时间。
6.引物设计原则
① 扩增产物长度建议控制在80~200 bp;
② 引物长度为18~25 bp;
③ 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1 ℃为佳,Tm值控制在58~62℃为佳;
④ 引物的GC含量控制在40%~60%之间;
⑤ 引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀,避开T/C或者A/G的连续结构(特别是3'端);
⑥ 引物3'端 一个碱基 为G或者C;
⑦ 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列;
⑧ 使用NCBI BLAST功能检索确认引物的特异性。
运输与保存方法 Transportation and preservation methods
长期保存请于-20℃避光保存,Mix融解后可在4℃避光条件下稳定存放一个月,尽量避免反复冻融。
常见问题Common Problem
扩增曲线形状异常
① 扩增曲线不光滑:信号太弱,经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验;ROX类型使用错误,确认所用ROX与机型是否匹配。
② 扩增曲线断裂或下滑:模板浓度较高,基线的终点值大于CT值。减小基线终点(CT值-4),重新分析数据。
③ 个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心,进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
反应结束无扩增曲线出现
① 反应循环数不够:一般设置循环数为40,但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号,降低数据可信度。
② 确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
③ 确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除其降解的可能。
④ 模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从 浓度做起。
⑤ 模板降解:重新制备模板,重复实验。
CT值出现太晚
① 扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计合成引物。
② 模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从 浓度做起。
③ 模板降解:重新制备模板,重复实验。
④ PCR产物太长:推荐PCR产物长度为80~150 bp。
⑤ 体系中存在PCR抑制剂:一般为模板带入,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
阴性对照出现明显扩增
① 反应体系污染:更换新的Mix、ddH2O、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。
② 引物二聚体的出现:配合熔解曲线进行分析。
定量时标准曲线线性关系不佳
① 加样误差:提高模板稀释倍数,提高加样体积。
② 标准品降解:重新制备标准品,重复实验。
③ 模板浓度太高:提高模板稀释倍数。
熔解曲线出现多峰
① 引物设计不优:根据设计原则设计合成新的引物。
② 引物浓度太高:适当降 低 引 物 浓度。
③ cDNA模板带有基因组污染:重新制备cDNA模板。
实验重复性差
① 加样体积失准:使用性能较好的移液枪;将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中。
② 定量PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。
③ 模板浓度太低:模板浓度越低,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。