ChemStart SYBR Green qPCR Mix（化学染料法荧光定量PCR预混液）

（None Rox）说明书

产品信息 Products

产品描述 Product overview

ChemStart SYBR Green qPCR Mix（None Rox）染料法荧光定量PCR专用预混液是使用SYBR Green I 嵌合荧光法进行qPCR的专用试剂。其基于化学热启动Taq DNA 聚合酶，配合针对qPCR优化的合适Buffer，可以有效抑制非特异扩增，适用于进行高特异性的qPCR 反应。使用本品进行qPCR反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

使用方法 Usage method

1.适配机型

2.使用注意

① 因Mix中预混有染料，其保存或反应体系配制过程应避免强光照射；

② 使用前上下颠倒轻轻混匀Mix，请勿涡旋振荡混匀，避免产生过多气泡。

3.建议的qPCR反应体系

a.通常推荐的引物终浓度为0.2 μM，反应效果不佳时可在0.1~1 μM范围内进行调整。

b.推荐模板加样量为1~2 μL，如模板类型为未稀释cDNA原液，模板添加量不应超过总反应体系的10%。不同种类DNA模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可以进行梯度稀释，以确定 的DNA模板添加量。

4.qPCR反应程序(可根据机型适当调整)

两步法

40 Cycles

三步法

40 Cycles

a. 根据引物的Tm值进行退火（退火&延伸）温度的设定；若扩增片段在200 bp以内，延伸（退火&延伸）时间可以设置为15 sec；以外，延伸时间的设置还需根据您使用的qPCR仪所需要的数据采集 时间限制自行调整；

b.不同qPCR仪的熔解曲线采集程序有差别，一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。

5.实验优化

若使用默认反应条件反应性能不佳时，则需要进行反应条件的优化，可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行：

引物浓度调整

当引物终浓度在0.1~1.0 μM范围之间变化时，引物浓度越低，扩增特异性越高，但扩增效率会有所下降。

扩增程序优化

需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。

6.引物设计原则

① 扩增产物长度建议控制在80~200 bp；

② 引物长度为18~25 bp；

③ 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1 ℃为佳，Tm值控制在58~62℃为佳；

④ 引物的GC含量控制在40%~60%之间；

⑤ 引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避开T/C或者A/G的连续结构（特别是3'端）；

⑥ 引物3'端 一个碱基 为G或者C；

⑦ 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列；

⑧ 使用NCBI BLAST功能检索确认引物的特异性。

运输与保存方法 Transportation and preservation methods

长期保存请于-20℃避光保存，Mix融解后可在4℃避光条件下稳定存放一个月，尽量避免反复冻融。

常见问题Common Problem

扩增曲线形状异常

① 扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验；ROX类型使用错误，确认所用ROX与机型是否匹配。

② 扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于CT值。减小基线终点(CT值-4)，重新分析数据。

③ 个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

反应结束无扩增曲线出现

① 反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。

② 确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

③ 确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。

④ 模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从 浓度做起。

⑤ 模板降解：重新制备模板，重复实验。

CT值出现太晚

① 扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。

② 模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从 浓度做起。

③ 模板降解：重新制备模板，重复实验。

④ PCR产物太长：推荐PCR产物长度为80~150 bp。

⑤ 体系中存在PCR抑制剂：一般为模板带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。

阴性对照出现明显扩增

① 反应体系污染：更换新的Mix、ddH2O、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。

② 引物二聚体的出现：配合熔解曲线进行分析。

定量时标准曲线线性关系不佳

① 加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。

② 标准品降解：重新制备标准品，重复实验。

③ 模板浓度太高：提高模板稀释倍数。

熔解曲线出现多峰

① 引物设计不优：根据设计原则设计合成新的引物。

② 引物浓度太高：适当降 低 引 物 浓度。

③ cDNA模板带有基因组污染：重新制备cDNA模板。

实验重复性差

① 加样体积失准：使用性能较好的移液枪；将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。

② 定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。

③ 模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。